Lančana reakcija polimerazom
 | Ovaj članak ili dio članka nije pokriven izvorima. |
Lančana reakcija polimerazom, poznata i pod engleskom kraticom PCR (polymerase chain reaction), metoda je koja omogućuje umnažanje dijelova DNA pomoću enzima DNA polimeraze. Ovom metodom DNK se klonira bez potrebe za živim stanicama. Metodu je 1983. razvio američki biokemičar Kary Mullis za koju je 1993. dobio Nobelovu nagradu za kemiju.[1]
Bit kloniranja DNA je u izolaciji jednog lanca DNA iz složene smjese molekula DNA. Kloniranje je postiglo velike korake u razumijevanju sastava i funkcije gena i genoma. Klasično kloniranje dugotrajno je i tehnički zahtjevno, može potrajati nekoliko dana, jer su za umetanje u vektor kloniranja potrebne opsežne promjene DNA. Nakon ove faze slijedi prijenos vektora u stanicu domaćina, a kasnije i odabir odgovarajućih rekombinanta. LRP usavršava kloniranje dopuštajući pročišćavanje određenog fragmenta DNA u samo nekoliko sati. Ipak, metoda ima određena ograničenja: treba znati barem jedan dio fragmenta koji se želi klonirati.[2]
Kopiranje segmenata DNA provodi se korištenjem dvije kratke molekule DNM koje su komplementarne početnom i završnom dijelu segmenta koji se kopira, dodavanjem enzima, fiziološke otopine i deoksiribonukleotida (blokovi DNA). Reakcija se odvija u lancu, ponavljajući se nekoliko puta. Sa svakim ponavljanjem broj kopija pomnoženog odjeljka eksponencijalno se povećava; tako se nakon 20 ponavljanja reakcije teoretski može dobiti više od milijun kopija iz jedne kopije DNA. Temperatura reakcije mora se kontrolirati. Da bi se kratke molekule DNA (početni oligonukleotidi) vezale za početnicu (primer) koji se želi umnožiti, potrebno je da je ista u jednolančanom obliku (DNA je obično dvolančana molekula), a to se postiže kratkotrajnim zagrijavanjem DNA na 92 °C. ili više (ovaj stupanj naziva se denaturacija DNA). Da bi se početni oligonukleotidi „prilijepili” na uzorak, temperatura se mora ponovno spustiti (na 37 °C – 55 °C), a zatim ponovno prilagoditi uvjetima koji su optimalni za djelovanje DNA polimeraze.
Nekoliko godina nakon što je Mullis opisao metodu, drugi su je autori usavršili uporabom polimeraze Escherichia coli (koja ima optimalnu radnu temperaturu od 37 °C i razgrađuje se pri visokim temperaturama denaturacije) umjesto DNA polimeraze. Bakterija Thermus aquaticus, pronađena u vrućim izvorima u američkom nacionalnom parku Yellowstone. Ova polimeraza je termostabilna: optimalno djeluje na 72 °C i može podnijeti kratkotrajno zagrijavanje iznad 90 °C. Stoga više nije bilo potrebno dodavati svježi enzim u svaki ciklus, što je omogućilo automatizaciju postupka.
LRP se izvodi u precizno programabilnim termostatima; može se odrediti temperature, trajanje inkubacije, broj ponavljajućih ciklusa i slično. Reakcije se izvode u količinama od 20 μl do 100 μl. U klasičnoj izvedbi, koja je i dalje najčešća, proizvodi se analiziraju elektroforezom u agaroznom gelu nakon završetka reakcije. Novija implementacija, LRP u stvarnom vremenu (real-time PCR), omogućuje praćenje količine nastalog proizvoda u stvarnom vremenu i stoga je brža, ali omogućuje i kvantificiranje određene DNA u početnom uzorku.[3]
- Animacija LRP-a (engl.)