PCR
Izvor: Wikipedija
PCR - polimeraze lančana reakcija (engleski: Polymerase Chain Reaction) je metoda kojom se relativno kratki dio DNK umnožava u veliki broj identičnih kopija, bez korištenja živog organizma. Godine 1983. Kary Mullis je pronašao PCR metodu kojom se DNK umnožava bez kloniranja i to iz marginalno male količine DNK. Za to otkriće je sedam godina kasnije dobio i Nobelovu nagradu za kemiju. Cilj je umnožiti prisutnu dvonizu DNK - templatu (matrica ili mustra) koja je prisutna u veoma maloj količini. Pritom se može raditi samo o jednom genu ili pak o jednom dijelu gena ili pak jedan nekodirani dio DNK sekvence. Princip je vrlo jednostavan. To je postupak sinteze DNK tokom više puta ponavljanih ciklusa udupljavanja tako stalno uvećavanog broja raspoloživih DNK, a sve uz pomoć enzima po imenu DNK polimeraza. To znači da će oba jednolančana komplementarna niza koji čine DNK dupli helix u određenoj poziciji istovremeno početi da sintetiziraju novi komplementarni niz. Za efikasnu primjenu metode važno je dijelove sekvenci DNK poznavati. Polimeraze lančana reakcija odvija se u termocikleru. Taj uređaj zagrijava i hladi reakcione posudice koje se nalaze u njemu i to vrlo preciznim temperaturama i dužinama programiranih ciklusa. Da bi se spriječilo isparavanje sve će biti hermetički upakovano ili će reakcioni materijal biti prekriven slojem ulja. Da bi se izbjeglo gubljenje minimalne količine reakcionog materijala kondenzacijom na poklopcu, isti će biti zagrijavan na nešto preko 100°C.
Sadržaj |
[uredi] Standardni PCR
 |
Ovaj članak ili odjeljak nije wikipediziran. (Rasprava) Tekst članka treba preurediti u wikitekst. Potom uklonite ovaj predložak. |
Sve što je potrebno za jedan PCR je:
- Termostabilna DNK polimeraza;
- Nešto malo izlazne DNK koja će biti matrica za kopiranje komplementarnog DNK lanca-niza;
- Dva odgovarajuća oligonukleotidna primera;
- Pufer;
- Nukleotidi: A, T, C i G;
Osnovni uvjeti svih PCR programa su:
1. Inicijalno denaturiranje trajanje od 5 minuta na temperaturi od 94°C. Pritom se razdvajaju oba niza DNK koja služi kao matrica. U tom procesu će temperatura zatim biti snižena na 55°C da bi se desilo hibridiziranje masivno prisutnih oligonukleotidnih primera na već razdvojene nizove matrica-DNK (jednonize). Potom će temperatura biti povišena na 72°C. To je optimalna temperatura za Taq-polimeraze. Pritom će se primeri stalno produžavati sve dok se ne izgradi nova dvoniza DNK (dupli helix) potpuno identična početnoj DNK matrici. Pošto se komplementiranje odvija na oba niza (lanca) matrica-DNK, u jednom ciklusu će se tako broj DNK matrica udvostručiti. Postupak možemo u cijelosti u cilju umnožavanja matrica DNK, stalno obnavljati. Broj novonastalih DNK će se uvećavati geometrijskom progresijom ( 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64,...).
2. Trideset ciklusa koji slijede se dešava i to svaki:
DENATURIRANJE 30 sec. pri 94°C, ANNEALLING 30 sec. pri 55°C, ELONGACIJA 90 sec. pri 72°C
3. Na kraju jedna finalna alongacija u trajanju od 5 min pri temperaturi od 72°C da bi se bilo potpuno sigurno da su polimeraze završile svoj rad.
4. Reakcija će konačno biti ohlađena na 4°C.
[uredi] Laboratorijska iskustva rada sa PCR-om
Denaturirannje: S jedne strane denaturiranje je jedan vrlo brz proces koji počinje već na temperaturi od 70°C. S druge strane sve komponente trpe zbog povećane temperature: Polimeraze bivaju denaturirane, nukleotidi se raspadaju, a DNK matrica kao i primer bivaju depurinirani. Dovoljno argumenata da se postupak denaturacije dešava onoliko kratko koliko je to za postupak neophodno. Ustvari dovoljno je i vrijeme od 5 sekundi da se dva polinukleotidna lanca (niza) DNK duplog helixa razdvoje. Problem je još uvijek tehničke prirode da se postižu precizno odgovarajuće temperature u tubi PCR aparata.
Annelling temperatura: Ona se računa prema primeru koji ćemo upotrebljavati. Ima više programa koji ne izračunavaju samo teoretsku temperaturu stapanja primera, nego i potencijalne sekundarne strukture. Za izračunavanje temperature stapanja primera postoje različite formule. Evo jednog primjera koji se bazira na sadržaju primera – GC:
Tm = 4 X (broj G, odnosno boj C) + 2 X (broj A, odnosno T)
Ova formula je istini za volju primjenljiva samo za primere dužine do 30 baza. Jedna prilično bolja ali i za upotrebu komplikovanija formula je od Baldina. Ona je razvijena za izračunavanje temperature stapanja oligonukleotida pod uvjetima in-situ hibridiziranja.
'Tm = 81,5 + 16,6 X (log 10[ J+]) + 0,41 X (%G+C) – (875/n) – 1,0 X (%pogresnog uparivanja) – 0,63 X (%FA)'
J = Koncentracija jednovalentnih kationa u Mol/l,
%G+C = Udio baza Guanin i Citozin u procentima,
n = Broj baza u oligonukleotidu,
(%pogresnog uparivanja) = Broj pogrešno uparenih baza u procentima,
(%FA) = Udio furmamida u puferu u procentima. Ovaj dio formule otpada kod klasičnog PCR-a.
Gore spomenuta formula važi za kationu koncentraciju do 0,5 M, zatim GC –između 30 i 70% i duzinu oligonukleotida do 100 baza. Nedostatak ove formule je u tome da nije pogodna za korištenje kod oligonukleotida koji imaju manje od 30 baza. Vrijeme elongacije: mora biti podešeno dužini produkta koji planiramo dobit. Ako je ono suviše kratko, polimeraze neće stići da završe posao. Ako je suviše dugo, ostaje onda previše vremena polimerazama da da provode i pogrešne sinteze. Kada se Taq polimeraza primjenjuje , biti će odvojeno 2 minute po 1 kb.
Prelijevanje uljem: Kod klasičnih PCR automata potrebno je reakcioni materijal preliti sa nešto mineralnog ili parafinskog ulja da bi se spriječilo isparavanje materijala u reakcionoj posudici. (tečnost se inače kondenzira na poklopcu). Novi PCR automati zato imaju i grijač poklopca koji zagrijava poklopac do iznad 100°C,te se tako sprječava kondenzacija. Time ćemo šparati upotrebu ulja. Ipak oprez! Kondenzacione kapljice se ipak stvaraju. Sada na ivici tube između grijača i grijućeg poklopca. Dok ovo nema bitnijeg utjecaja na veće volumine, dotle će kod manjih volumina (<20ml) odnosi koncentracija biti znatno poremećeni te će biti nemoguće izvršiti uspješnu amplifikaciju. Zato u ovim slučajevima treba koristiti i ulje iako imamo na uređaju poklopac koji se zagrijava.
Matrica: Poželjno je da je matrica što je moguće kvalitetnija. Ipak, nekada PCR funkcionira optimalno iako nemamo bas «najoptimalniji» materijal u obradi.
Faktor multiplikacije: U PCR postupku se teoretski DNK molekula iz ciklusa u ciklus udupljava. Bilo bi dobro kada bi tako i bilo. Međutim, realno multiplikacioni faktor od ciklusa do ciklusa od 1,6 – 1,7 , a nekad i niže (znači faktor nije 2 sto je teoretski očekivati). Stvarnost je vrlo komplicirana jer ne umnožavanje na početku PCR prilično nisko. Pretpostavlja se da na početku matrica, enzimi i primeri imaju problema da se međusobno «susretnu» u pravo vrijeme i na pravom mjestu. Vjerojatnoća susreta raste sa konstantnim povećavanjem broja novih matrica. Međutim pri kraju reakcije faktor multiplikacije ponovno drastično opada jer je umnožavanje u značajnoj mjeri inhibirano (kočeno) od strane pirofosfata, rasutih nukleotida i rehibridiziranog produkta.
Količina matrice: Teoretski dovoljan je jedna jedina molekula matrice. Ipak, u praksi je potrebno najmanje 10 000 matrica DNK da bi se bez problema pristupilo amplificiranju. Izračunavanje broja molekula DNK u jednoj količini koja vam stoji na raspolaganju, vrlo je teško. Pomoći će nam sljedeće globalne proporcije: 100 000 molekula matrica-DNK odgovara otprilike 0,5 pg plazmid-DNK, 300 ng čovječje genomske DNK. U većini slučajeva ove količine mogu biti bitno drugačije. U svakom slučaju ne treba upotrebljavati velike količine matrice. Rezultat može biti bas suprotnost onome što očekujemo. Vjerojatnoga pogreške je znatno veća kod većih količina matrice jer reakcija može prerano dostići fazu zasićenosti što će se negativno odraziti na konačnu kvalitetu produkta. Interesantna ideja je ponovna upotreba matrica-DNK koja je publikovana od (Sheik i Lazarus – 1997.) Autori opisuju kako su kao matricu primjenjivali nylon membrane na koje je blotom nanesena DNK. Ovakvu matricu je uistinu moguće nekoliko puta primjenjivati, ali je nezadovoljavajuće amplificiranje fragmenata dužih od 850 bp.
Pufer: Taq polimeraza ima maksimum aktivnosti pri pH vrijednosti iznad 8. S tim u vezi u zadnje vrijeme se eksperimentira sa raznim puferima, ali bez nekog značajnijeg pomaka. Često se upotrebljava pufer sa pH 8,3 na 20°C. Međutim tokom PCR-a njegova vrijednost će se iskazivati kao pH 7,8 do 6,8. Zbog toga se sve češće uzima i Tris-Pufer od pH 8,55 pa čak i pH 9. Soli: Kod soli je izbor nešto veći. Upotrebljava se KCl (do 50 mM) ili pak (NH4)2SO4 (do 20mM). MgCl2: Koncentracija Mg2+ utječe na: annealing primera, razdvajanje nizova pri denaturiranju, specifičnost produkta, građenje primar dimera te na ratu grešaka. Osim toga enzim treba sa svoju aktivnost slobodni Mg2+. Optimalna koncentracija je između 0,5 i 2,5 mM.
Dodaci: Ako PCR reakcija ne funkcionira onako kako bi trebalo, te ako promjena koncentracije ne donosi željeni efekt Mg2+, onda se može sa različitim dodacima pokušati. Dimethilsulfoxid (DMSO) (do 10% v/v), te Formamid (do 5% v/v) mogu povećati specifičnost te olakšati amplifikaciju GC-bogatih sekvenci. Osim toga Glycerin(10-15% v/v), PEG 6000, te Twenn®20 može ubrzati reakciju. Nema pravila što bi trebalo i koliko primijeniti. Jednostavno, mora se isprobati.
Koncentracija nukleotida: U standardnim protokolima stoji koncentracija nukleotida od 200 μM
Pirofosfataze: Od kako je iz termostabilnih bakterija pored polimeraza izolirane i pirofosfataze, moguće je iz reakcionog produkta izdvojiti pirofosfat. Tako se uz upotrebu pirofosfataza postiže bolji kvalitet produkta. Primer mora biti točno pripremljen za određenu amplifikaciju. PCR primeri obično imaju dužinu 18-20 baza. Primer ne bi trebao da sadrži jednu iza druge više od četiri iste baze.
Aktivnost Taq polimeraze ovisna je od temperature. Iako termostabilne polimeraze imaju svoj optimum rada u području temperatura oko 70°C, to ne znači da ce one pri drugim temperaturama biti neaktivne (inaktiv). Ilustrirati ćemo to sljedećim podatkom: Pri temperaturi od 70°C Taq polimerqaza ostvaruje svoju ratu aktivnosti od oko 2800 nukleotida u minuti. Pri temperaturi od – 55°C 1400 nukleotida/min. Pri temperaturi od 37°C – 90 nukleotida/min. Pri temperaturi od 22°C samo 15 nuleotida/min. To omogicava na primjer ostvarivanje programa sa samo jednom Annealing/Elongation fazom pri temperaturi od 60°C. Ostaci aktivnosti Taq polimeraze pri nižim – sobnim temperaturama neće nam stvarati probleme. Ilustracije radi, recimo da je reakcioni materijal nakon postupka amplifikacije moguće ostaviti u PCR automatu preko noći na sobnoj temperaturi a da ne dođe do promjena bitnih za iskazivanje konačnih rezultata. Međutim, relativno niske sobne temperature će biti problematične za polimeraze sa korektivnim osobinama. Ustvari Pfu, Pwo i Tli, pri sobnim temperaturama ne razgrađuju samo prekomjerne primere nego razgrađujući djeluju i na PCR proizvod. To je razlog sto PCR reakcioni materijal koji sadrzi polimeraze sa korektivnim aktivnostima, nakon završene amplifikacije mora biti u uređaju (automatu) hlađen dok ne počne njegova dalja primjena.
Polimeraze: Klasična polimeraza za PCR je Taq – DNK polimeraza izolirana iz bakterije stabilne i na visokim temperaturama od oko 70°C vode termalnih izvora. Bakterija se zove Thermus aquaticus. Ovo čudo od «enzima» ima maksimalnu aktivnost (djelotvornost) pri temperaturi od 74°C i pH 8, Pored 5´-3´ Exonukleze aktiviteta ne postoje i 3´-5´ exonukleaze aktiviteti. Taq polimeraza ce pored svoje (normalne) aktivnosti u vezi sa matricom provoditi i polimerazne aktivnosti koje nisu direktno vezane za matricu. Ove aktivnosti imaju za posljedicu da je često na krajevima novonastalih lanaca (nizova) obješena (okačena, vezana) jedna dodatna baza koja nije prisutna na nizu DNK koja je poslužila kao matrica. Najčešće se radi o jednom Adenosinu. Rata sinteze DNK je oko 2800 nukleotida/min.
Greške: Rata grešaka kod polimeraza sa korekturnom aktivnošću je otprilike 106 baza ( jedna greška na jedan milijun baza). Kod polimeraza bez korektivne funkcije rata greška je otprilike 10 puta veća. Za sada Pfu imaju najnižu ratu grešaka među svim dosad poznatim termostabilnim DNK polimerazama. Što bi sve ovo značilo u praksi? Ako u PCR postupku koristimo Taq polimerazu imati ćemo pritom 10000 molekula matrice i produkt duzine 1000 bp. U prvom ciklusu ce 1 procent novogeneriranih fragmenata imati jednu mutaciju. U drugom ciklusu tome će se pridružiti jos skoro 1% novih mutacija i tako redom. Nakon 30 ciklusa mora se računati sa otprilike 25% fragmenata koji imaju jednu ili više mutacija. Isti PCR sa jednom Proofreading polimerazom stvoriti će samo negdje oko 3 posto mutiranih fragmenata.
Koncentracija enzima: Uobičajeno je da se u reakcioni materijal od 50 ml unese jedna jedinica (unit) Taq polimeraze, Kada se radi o polimerima sa proofreading aktivitetom biće potrebna znatno manja količina polimeraze.
[uredi] Nested PCR
Klasični problem je u tome što je teoretski moguće od jednog jedinog molekula DNK mustre multipliciranjem u PCR postupku dobiti željenu (teoretski i ogromnu) količinu novih – identicnih molekula DNK. Međutim, ako na tome u praksi insistiramo uglavnom nećemo time postići željeni cilj. Nakon otprilike 40 ciklusa udio pogrešnih hibridiziranja naglo raste tako da će nakon jednog velikog broja ciklusa rezultat biti jedna razmrljana nejasna masa nekorisna za očitavanje. Jedan trik da se dokazu i vrlo male količine DNK koja je mustra je nested PCR. Jedno neobično ime za jedan vrlo jednostavan postupak. Prvo ćete provesti PCR postupak sa malom količinom matrice koja vam je na raspolaganju. Nakon toga ćete dobiveni produkt primijeniti kao matricu u novom postupku amplifikacije sa novim primerom. Pritom će drugi primer vezati između prvih. Ovom metodom moguće je zaista dokazati vrlo male količine matrice. Metoda omogućava dokazivanje skoro svake cDNK u skoro svakom tkivu jer svaka stanica eksprimira skoro sve gene. Iako zaista na vrlo niskoj razini.
[uredi] Multiplex PCR
Metoda je odgovor na pitanje; ako želimo na jednoj te istoj DNK matrici učiniti vise amplifikacija, možemo li jednostavno u reagensnu posudu dodati mnogo (odgovarajuće dovoljno) primera? Kao sto je Chamberlain 1988. godine dokazao – moguće je i to. On je koristio i do šest primera, ali to nije i granica. Cak i 36 primera u jednoj tubi biti ce sasvim uspjesno amplificirano. U novije vrijeme bilo je i pokušaja sa cak 100 primera. Preduvjet je da primeri ne amplificiraju homologe sekvence jer će u tom slučaju doći do pogrešnog annelinga primera ili konačnog produkta. Rezultat bi onda bio samo nejasan - razmaz u agaroze gelu. Uopće, dokazivanje (očitavanje) pojedinačnih fragmenata sa stalnim porastom primera biti će sve teže. U slučaju manjeg broja fragmenata za uspješno očitavanje biti će nam dovoljna i njihova različita dužina koju uočavamo. U slučaju značajnijeg porasta broja fragmenata pomoci će nam markiranje fluoroscentno markirani primeri te razdvajanje PCR produkta u postupku automatskog sekvenciranja. Ako imate da dokazete veliki broj fragmenata koristicete onda vjerovatno dokazivanje uz pomoć hibridiziranja. Npr. Strips hibridiziranje ili pak microarays. Na početku će vam Multiplex PCR činiti puno problema tako da ćete prilično puno vremena potrošiti na optimiranje primera i uslova PCR postupka. Zato je ova metoda uglavnom pogodna za Screenings (očitavanja) kod kojih u proces ulazi uvijek isti primer.
[uredi] Amplifikacija dugih DNK fragmenata (>5kb)
Istini za volju Taq polimeraza je vrlo efikasna, ali omogućava zaista kratke kratke amplifikacije (do 5 kb). Razlog za to je u načinu rada Taq polimeraze koja nakon ugradnje jedne pogrešne baze počinje da «zapinje» zastajkuje, zapravo da gubi kontinuitet i efikasnost. Postupak se ponekad potpuno zaustavi ili se pak elongacija odvija vrlo lagano. Zato će u sljedećoj PCR ciklusu doći do pogrešnog hibridiziranja što konačno vodi akumuliranju pogrešnih amplifikata. Na kraju ćemo na agaroza gelu imati samo jednu veliku razmazanu mrlju. Godine 1994 u ovoj oblasti se desio značajan prodor. Dok je popularnim riječnikom opisano, Tag polimeraza vrlo brza ali «kratkog daha" i omogućava amplifikaciju samo manjeg broja kb, Pfu polimerza je točnija i «dužeg je daha», ali sa prilično malom količinom konačnog produkta, pa zato takođe nepodesna za amplifikaciju dugih fragmenata. Naučnici Barnes i Cheng su dosli na ideju da kombiniraju pozitivne osobine ove dvije sasvim različite polimeraze. Oni su ih pomiješali u omjeru 11 dijelova Taq naspram 1 dio Pfu polimeraze. To je omogućilo vrlo amplifikaciju fragmenata dužine do 50 kb u najmanju ruku – ponekad. Većina proizvođača termostabilnih polimeraza razvila je u međuvremenu slične mixure.
[uredi] Primjena PCR metode
Čini se da su mogućnosti primjene PCR-a u ovom trenutku neograničene. U svakom slučaju PCR će još dugo, dugo vremena u molekularnoj biologiji biti metoda «broj 1». Značaj PCR metode je vrlo veliki kako u području gentehničkih eksperimenata tako i u istraživanjima na području molekularne biologije te u biotehnologijama. Nove spoznaje na molekularnom nivou narastaju kao lavina posebno u medicini (dijagnostika). Ovdje ćemo prikazati samo nekoliko primjera primjene.
- HIV Test je razvio Hoffmann la Roche u Baselu, a pokazuje ne samo primjenu PCR metode, nego i primjenu hibridizacije u dijagnostici.Ovaj test odvija se na sljedeći način: Iz krvnog uzorka pacijenta biće izolirani leukociti da bi se potom pristupilo izdvajaju njihovih DNK. Ako je pacijent inficiran HIV virusom, onda ce DNK leukocita sadržavati i HIV-DNK. Iz leukocita izolirana DNK biće u PCR automatima ampfliciranma. Primer za reakciju su naravno DNK dijelovi (oligonukleotidi) sa poznatim sekvencama HIV-DNK. Nakon sto pri povećanju temperature do 95°C DNA dupli helix bude razdvojen na dva pojedinačna nukleotidna lanca, primeri će "tražiti svoje" komplementarne DNK sekvence. Međutim, u reakcionom rastvoru one mogu biti pronađene samo ako je prisutna HIV-infekcija. Ako nema infekcije, primari se neće nakupljati (lagerovati), te neće doći do PCR-ampflikacije HIV-DNK. Ako je infekcija prisutna, HIV-DNK će biti prisutna u rastvoru, pa će se pri hlađenju primeri nakupljati (lagerovati) na "svojim" sekvencama. Pritom počinje svoje djelovanje Taq-polimeraza. Nakon određenog broja reakcionih ciklusa biće dovoljno HIV-DNK ampflicirano da bi se moglo pristupiti dokazivanju. Količina prisutne DNK će biti tolika da se pri dokazivanju možemo odreći eksperimenta sa radioaktivnošću. Biće dovoljne metode bojenja.
Kod ovog testa dokazivanje se vrsi na sljedeći način: molekule primera su pri sintezi dodatno povezane još sa jednim biotin-molekulom. To ni najmanje ne utiče na aktivnost Tag-polimeraze prilikom PCR ciklusa. Ako su PCR ciklusi završeni, ampflicirana DNK će biti nanesena na specijalne ploče. Ta tzv. mikrofilter ploča (plata) je naprava za hibridiziranje. Na njoj je jednonize HIV-DNK već pričvrsćena. Ako tome dodamo ampfliciranu DNK takođe u jednonizoj formi, a radi se pritom o DNK inficiranog pacijenta, na mikrotiter ploči će se pod uslovima reakcije komplementarne sekvence međusobno tražiti i naći. Nakon određenog vremena mikrotiter ploča će biti očišćena specijalnim rastvaračem. Pritom će nepovezana DNA (u ovom slučaju DNA koja nije HIV-DNA) biti isprana. Zatim će biti primijenjena metoda bojenja koja će prepoznati i obojiti biotin-molekula. Posto je HIV-primer markiran biotinom, HIV-DNA će biti obojena te će je biti moguće tako uočiti i dokazati. Preciznost dokazivanja je enormna. Viralnu DNK je moguće dokazati već ako je samo 1 od 10000 leukocita inficiran.
- PCR u forenziku: PCR je kao malo koja metoda molekularne biologije postala u javnosti veoma poznata Tome je posebno doprinijela široka i vrlo efikasna primjena u sudskoj medicini /forenziku/. Ranije mnogi neriješeni slučajevi zločina mogo danas sa 99,9% tačnosti biti dokazani. To je uz ostale dokazne materijale omogućilo i PCR ampflificiranje malih količina DNK počinilaca ili pak žrtava. Kako je to moguće? Šta je na DNK čovjeka tako izuzetno individualno da može poslužiti kao znak prepoznavanje jedne individue kao sto je to već od ranije poznati otisak prstiju. Jednako izuzetan je i tzv. "genetski otisak prstiju" (engl.:DNK-fingerprint). Plan izgradnje proteina u čovječijem organizmu je u bitnom isti. Ako su DNK sekvence za proteine našega organizma uglavnom iste, gdje su onda individualne razlike na osnovu kojih bismo mogli izvršiti identifikaciju jedne osobe.
Kod čovjeka su ukupne informacije naslijeđa (genom) kodirane na oko 3 milijarde nukleotida. Zapravo kodirane sekvence zauzimaju od toga samo 5-8%. Čemu onda sluzi ostalih 92-95% nukleotidnih parova. Nosimo li mi to možda balast evolucije? Zbog nedostatka spoznaja, ranije su te sekvence nazivane "nijeme DNK" (engl. silent DNK) Međutim, u međuvremenu su dijelovi te DNK počeli "govoriti". Naime, pojedini odjeljci našeg genoma se uvijek iznova ponavljaju i to odredbenim redom. Dakle, oni su prisutni u višestrukom ponavljanju (engl.: repeats) i to kao flankirni pratioci kodiranih gena (flankirati= sa strane ograničavati, bočno obilježavati, bočno osiguravati). Na osnovu takve pozicije taj dio DNK je dobio naziv satelitska DNK. Ta satelitska DNK je kod svake osobe potpuno različita- individualna kao sto je za svaku osobu specifičan otisak prstiju. Ako se satelitske DNK dovedu u reakciju sa nekoliko enzima, a zatim elektroforezom na agaroza-gelu razdijeli - selekcionira po veličinu, nastaće traka sa mustrom tamnih i svijetlih polja. Za svakog čovjeka postoji samo jedna specifična mustra. DNK trake moguće je bojenjem učiniti vidljivim. Te karakteristične mustre traka koje su nastale nakon sto smo satelitske DNK obradili određenim enzimima nazivamo "genetički otisak prstiju". Naravno ovo je našlo i veoma široku primjenu kod utvrđivanja očinstva. Jednako dobro ova metoda može poslužiti i u dokaznom postupku zločina. Male količine DNK iz sperme, krvi /1 micro l/ ili pak samo korijen jedne dlake počinioca nađene kod žrtve može poslužiti da se DNK izolira. U PCR-u ona će biti umnožena da bi potom bila primijenjena u genetičkom fingerprintu.
[uredi] Dalji razvoj PCR-a
Na osnovama PCR metoda već je razvijena desetina novih postupaka koji su prilagođeni zahtjevima genprodukta koji želimo amplificirati.
- RT PCR (Reverse transcription PCR) je metoda kojom se na temelju RNK sintetizira jednolančana molekula DNK koja se zatim dalje umnožava. U ovom slučaju će prvo od jedne željene RNK biti dobivena cDNK koja ċe konačno biti upotrijebljena kao matrica u jednom PCR. Područje primjene je vrlo veliko. Na primjer, na ovaj način se može dokazati transkripcija jednog gena u točno određenom tkivu ili stanici.
- Rapid (brza) amplifikacija krajeva cDNK (RACE) je ustvari RT PVR – reverzna transkriptaza PCR samo urađen drugim sredstvima. Zavisno od toga da li će biti produzeni, krajevi 5´ ili 3´ razlikovati će se i protokoli. Kod 3´-RACE provodice se cDNK sinteza sa jednim modificiranim Oligo-dT-primerom često označen kao sidro primer.
- Amplifikacija slučajnih produkata
- "Real-time" quatitativni PCR
- Inverzni PCR
- Biotin- Rage i suport PCR
- Mutageneza sa modifikovanim primerom
- ARMS (Amplifikation Refractori Mutation System
- In-situ PCR
- Cycle Sekvenciranje
- Sinteze cDNA
- Jedna stanica PCR
