1. ŽNL Vukovarsko-srijemsku je u sezoni 2000./01. činilo 28 klubova iz Vukovarsko-srijemske županije podijeljenih u dvije grupe. Pobjednici grupa bi igrali finale čime bi bio odlučen prvak lige, odnosno klub koji će biti promoviran u 3. HNL – Istok. Iz lige su ispadali 14-oplasirani klubovi iz obje grupe, dok bi u slučaju da iz 3. HNL – Istok ispada više klubova iz Vukovarsko-srijemske županije, u 2. ŽNL Vukovarsko-srijemsku ispao jedan ili oba 13-oplasirana kluba.